Initialement, notre problématique était bien plus ambitieuse que celle présentée ici : nous voulions savoir si il y avait une sélection suivant la taille dans la façon dont les paramécies phagocytent puis traitent en interne les éléments phagocytés. C'est pour cette raison que nous avons fait deux tailles de QDs, nous espérions pouvoir faire des expériences pour observer des différences potentielles entre les deux et ainsi déterminer si il y avait un tri ou non suivant la taille des QDs.

Néanmoins, les résultats que nous avons obtenu ne nous permettent pas de conclure quant à cette question. La répartition des QDs dans les paramécies semblent similaires pour les deux tailles (rouge et verte) mais rien n'indiquent que ce soit vraiment le cas ni que les QDs soient arrivés dans cette configuration en suivant des chemins similaires. Les difficultés rencontrées au cours du projet et le manque de temps font que nous n'avons pas pu mener d'expériences supplémentaires pour tenter de répondre à cette question. Celle-ci reste donc ouverte à quinconce voudrait poursuivre cette étude.

Pour ceux qui souhaiteraient reprendre nos expériences et poursuivre l'étude afin de répondre à notre problématique initiale, vous trouverez ci-dessous l'ensemble de nos protocoles. Mais voilà en plus quelques petites observations et réflexions que l'on a pu faire et qui pourrez vous être utile pour vos démarches.

Pour pouvoir effectivement observer un éventuel tri des QDs par les paramécies, il faudrait pouvoir faire observer en continu la paramécie, soit observer la paramécie à partir du moment où elle phagocyte les QDs jusqu'au moment où elle les rejettent dans le milieu. Il faudrait réaliser cela avec les verts, les rouges et les deux ensembles en changeant régulièrement le filtre du microscope UV pour observer alternativement les deux tailles.

Pour réaliser un suivis continus du traitement des QDs par les paramécies, il serait nécessaire de modifier le protocole d'immobilisation. En effet, celui que l'on utilise est brutal et touche à l'intégrité des paramécies, de ce fait, il peut potentiellement affecter le comportement interne de la paramécie ce qui pourrait donner des résultats biaisés par des observations qui seraient dûes à la déciliation. Au cours de nos expériences, nous avons constaté que les position des QDs dans une paramécie que l'on observait un long moment ne variaient pas et que les QDs restaient au sein des paramécies bien plus longtemps que les temps estimés, il semble donc peu possible de faire du suivis continu dans ces conditions. Un changement dans le protocole d'immobilisation permettrait cependant d'en faire. Certaines pistes comme tenir les paramécies à l'aide de pinces adaptées ont été envisagés au cours de nos recherches mais la difficultés techniques de ces protocoles nous ont fait choisir des techniques plus simple à mettre en œuvre avec nos moyens.

Enfin, il serait également intéressant, dans le cas d'un suivis continu, d'être à même de contrôler le nombre de QDs mis en contact avec les paramécies pour ne pas avoir à procéder à une étape de lavage du milieu pour enlever les QDs non phagocytés qui gêne l'observation. L'idéal serait d'avoir une ou deux paramécies déjà plus ou moins immobilisées auxquelles on ajoute un nombre contrôlé de QDs en observant déjà le tout au microscope UV. Il serait alors possible d'observer l’absorption des QDs et les trajets effectués au sein des paramécies d'une seule traite et sans discontinuité. Pour ce faire, il serait envisageable de créer un système microfluidique qui pourrait contrôler l'afflux des QDs et ainsi réguler leur nombre.

Nous avons synthétisé deux types de quantums dots : des rouges et des verts. Voici le protocole pour les faire chacune en milieu organique puis celui à faire aux deux types de quantums dots pour les passer en milieu aqueux.

Synthèse des quantums dots rouges à 641 nm :

Introduire dans un ballon :

• 1 mmol de CdO (128mg)
• 3 mmol d’acide myristique (685mg)
• 15 mL d’octadécène (ODE)

Dégazer sous argon à 40-60°C pendant 10min.

Chauffer jusqu’à 310°C puis injecter séparément à l’aide d’une seringue (le tout en 1min):

• 0,5 mL de triocytlphosphine (TOP) à 1M de Se (~39mg de Se)
• 3mL de Zn(OAc)2 (O,5 M) + 240 µL dodécanethiol (DDT)

Continuer de chauffer à 310°C pendant 30 min
Injecter séparément :

• 1,5mL de TOPS (~6mmol -> 192mg)
• 3,6mL de Zn(OAc)2
• 2,4 mL de Cd(OA)2 au goutte à goutte

Attendre au moins une heure
Refaire une injection.
Retirer le surnageant.
Ajouter 5 mL d’hexane. Si ce n’est pas assez limpide, rajouter 10mL d’hexane.
Centrifuger.

Synthèse des quantums dots verts à 529 nm :

Introduire dans un ballon :

• 0,4 mmol de CdO (51mg)
• 4 mmol de Zn(OAc)2 (734 mg)
• 17,6 mmol d’Acide Oléique (OA) (5,5 mL)
• 20 mL d’octadécène (ODE)

Dégazer sous argon à 90°C pendant 20min

Chauffer jusqu’à 310°C puis injecter en même temps à l’aide d’une seringue:

• 0,025mmol de Se (2 mg)
• 4 mmol de S (128mg)
• 3 mL de triocytlphosphine (TOP)

Continuer de chauffer à 310°C pendant 10 min (on observe une couleur rouge).
Laisser refroidir (on observe un changement de couleur du rouge vers le orange puis vers le vert)

Répartir le contenu du ballon dans deux tubes falcons (de 50 mL chacun).
Compléter avec de l’éthanol jusqu’à 45 mL (on observe la formation d’agrégats)
Centrifuger (~6 000 RPM pendant ~7min)
On doit observer l’apparition d’un précipité marron-orange
NOTA : si ce n’est pas assez précipité, ajouter 5mL de méthanol dans chaque falcon puis centrifuger de nouveau

Pour les deux tubes falcons:
Retirer le surnageant puis compléter de nouveau jusqu’à 45mL avec du méthanol.
Centrifuger.
De nouveau, retirer le surnageant puis compléter jusqu’à 45mL avec du méthanol. Centrifuger
Retirer le surnageant.
Dissoudre le précipiter dans 5mL d’hexane. Centrifuger

Réunir les contenus des deux tubes falcons dans un pilulier.

Passage en milieu aqueux

Mélanger 200µL de solution de QD avec de l’éthanol (jusqu’à précipitation).
Ajouter 200 mg de HLA-PEG + 20 mL de toluène
Attendre 24h.
Eliminer le surnageant.
Faire précipiter les QD avec une solution éthanol/hexane
Centrifuger (5 000 RPM pendant 5min)
Eliminer le surnageant. Séchage (avec le pistolet).
Mélanger le précipiter avec 600µL d’eau mQ
Filtrer les ligands restant (centrifugeuse)
Ajouter de l’eau (300µL pour les QD rouges ou 400µL pour les QD verts)
Centrifuger (12 000 RTM pendant 5min)

On obtient 900µL de QDs rouges et 1 000 µL de QDs verts

Mesurer les spectres d’absorptions et émission des QDs synthétiser, ils peuvent légèrement varier d'une synthèse à l'autre

Calcul des concentrations

Il faut en premier lieux déterminer le diamètre des particules à l’aide du spectre d’absoprtion.

Pour les QD entre 2 et 7 nm:

D=(1,6122.10-9).λmax4 – (2,6575. 10-6). λmax3 + (1,6242. 10-3). λmax2 - (0,4277. λmax) + 41,57

(source : http://docnum.univ-lorraine.fr/public/DDOC_T_2014_0006_KAUFFER.pdf - p57)

A l’aide de Beer-Lambert on calcule le coefficient d’absorption C = Aλmax / ε *l où l=largeur de la cuve.
Enfin, ε= 5857 D2,65 (même source que ci-dessus)

Nos résultats:

• l= 1cm

Pour le rouge :

• λmax=640nm
• Aλmax=1,8
• D=6,95nm
• ε=9,97.105 cm-1M-1
• C=1,8 µmol/L

Pour le vert :

• λmax=528nm
• Aλmax=1,96
• D=2,67nm
• ε=7,89.104 cm-1M-1
• C=24,85 µmol/L

Préparer le milieu dans lequel les paramécies vivent : le milieu BHB

Pour 1 L de milieu BHB

Produits nécessaires :

• poudre de BHB
• Trizmahydrocloride
• Na2HPO4, 12 H2O
• NaH2PO4, H2O ou NaH2PO4, 2 H2O ou la poudre anhydre

Faire une infusion 20x : Prendre 2,5 g de poudre de BHB et les mettre dans 50 mL d'eau, faire bouillir 20 min, filtrer trois fois et réajuster à 50 mL

Faire un tampon 20x : Dans 50 mL d'eau mélanger 0,75 g de trizmahydrochloride, 1,5 g de Na2HPO4, 12 H2O et 0,125 g de NaH2PO4, H2O ou 0,15 g de NaH2PO4, 2H2O ou 0,1125 g de la poudre anhydre

Mélanger 900 mL d'eau avec 50 mL de tampon 20x et 50 mL d'infusion 20x

Mettre à l'autoclave pour 20 min à 120°C

Préparer une nouvelle colonie de paramécies à partir d'une ancienne colonie :

Produits nécessaires :

• colonie de paramécies
• colonie de bactéries
• milieu BHB
• facultatif Béta-stérol

Commencer par refaire une colonie de bactéries : prendre une partie de la colonie de bactéries existante et la mettre dans un nouveau tube avec suffisamment de milieu BHB. /!\ Il est important de toujours avoir une colonie de bactéries et uniquement de bactéries pour avoir de quoi créer de nouvelles colonies de paramécies et assurer ainsi leur survie au cours du temps /!\

Faire la nouvelle colonie de paramécies : Prendre le reste de l'ancienne colonie de bactérie et y introduire une partie de la colonie de paramécies existante, rajouter au besoin du milieu BHB

Note : n'oubliez pas que les paramécies ont besoin d'oxygène pour survivre, il faut donc toujours veiller à ne pas fermer complétement les tubes dans lesquels vous faites vos colonies. Les manipulations doivent être fait dans un environnement suffisamment stérile pour ne pas infecter vos colonies avec des bactéries et champignons extérieurs, pour cela vous devez toujours travailler sous un cône de stérilité que vous pouvez faire à l'aide d'un bec benzène par exemple

Si vous souhaitez que votre colonie grandisse plus vite (que ce soit pour une nouvelle ou une ancienne qui ne serait pas assez développée pour ce que vous voulez faire), vous pouvez rajouter du Béta-stérol en respectant la proportion de 10 µL pour 20 mL de milieu avec paramécie

Aucune valeur n'est donné ici car les quantités à mettre dépendent des quantités que vous avez à disposition, du volume de la colonie que vous voulez faire, de la concentration que vous voulez qu'elle ait et au bout de combien de temps vous voulez qu'elle soit à cette concentration ou encore du temps que vous voulez que cette colonie soit capable de survivre avant d'avoir besoin de faire quelque chose (remettre des bactéries et du milieu, refaire une colonie...)...

Calculer la concentration en paramécies d'une colonie :

Prélever un échantillon de volume connu de votre colonnie

Compter au microscope le nombre de paramécies dans cet échantillon

Faire plusieurs prélèvement pour une meilleure précision : le nombre de paramécies prélevées peut dépendre de l'endroit de la colonie pipetée, ne pas hésiter pour cela à mélanger délicatement la colonie pour l'homogénéiser (par exemple en aspirant et expirant dans la colonie à plusieurs reprises avec la pipette avant de faire le prélèvement )

Produits nécessaires :

• milieu BHB
• Carboxyméthylcellulose (CMC) ou Gelzan

Faire chauffer 2,5 mL de milieu BHB
Rajouter 75 mg de CMC ou 32,5 mg de Gelzan
Laisser refroidir et rajouter 2,5 mL de BHB

La quantité de CMC ou Gelzan peut varier suivant la viscosité du gel souhaitée

Produits nécessaires :

• Éthanol
• EDTA à 1%
• Volvic (il est important que ce soit de la Volvic, les paramécies ne supportent un autre type d'eau)
• CaCl2 à 1 mM

Préparer une solution de 400 µL d'éthanol, 40 µL d'EDTA à 1% et 3 mL de Volvic qui servira pour plusieurs immobilisations

Prélever 145 µL de paramécie à une concentration d'environ 1,5 paramécies/µL et les mettre dans un tube.

Ajouter 895 µL de la solution Eth/EDTA/Volvic

Attendre 1 min

Ajouter 20 µL de CaCl2 à 1 mM

Produits nécessaires :

• colonie de paramécies à 1,5 paramécies/µL environ
• Quantums Dots
• Produits pour l'immobilisation

Mélanger 140 µL de paramécies avec 5,6 µL de quantums dots

Attendre une quinzaine de minutes au moins

Procéder au protocole d'immobilisation des paramécies

Centrifuger les paramécies immobilisées à 1000 RPM (180 RCF) pendant 4 mins

Retirer le surnageant

Centrifuger de nouveau

Retirer le surnageant

Récupérer le fond pour l'observer au microscope à UV-Fluo